Μετάφραση: Απολλόδωρος. Ο παραπάνω ορισμός για την καθαρότητα προέρχεται από την Καθοδήγηση του FDA για τη βιομηχανία. Σύμφωνα με τον FDA, η καθαρότητα θεωρείται σχετική ελευθερία από ξένα υλικά. Τι είναι η "σχετική ελευθερία";...
Η σχετική ελευθερία υπονοεί ότι κάτι είναι αληθές σε έναν ορισμένο βαθμό. Με άλλα λόγια, υπάρχει ελευθερία από ξένα υλικά σε έναν ορισμένο βαθμό. Ωστόσο, σε σχέση με την καθαρότητα, δεν μπορεί να υπάρχουν βαθμοί ελευθερίας από ξένη ύλη. Μια ουσία είναι είτε καθαρή, που σημαίνει ότι είναι απαλλαγμένη από όλες τις μολύνσεις και την ξένη ύλη, είτε είναι ακάθαρτη, που σημαίνει ότι είναι αναμεμειγμένη με μολύνσεις και ξένη ύλη. Δεν υπάρχει τέτοιο πράγμα όπως η καθαρότητα σε κάποιο βαθμό, παρόλα αυτά θα βρείτε συνήθως συζητήσεις για την καθαρότητα μέσα στα "επιστημονικά" έγγραφα σαν να μπορεί να ισχύει κάτι τέτοιο. Ορολογία όπως χαμηλή καθαρότητα, μερικώς καθαρισμένο, κάπως καθαρισμένο, σχετικά καθαρισμένο, πολύ καθαρισμένο κ.λπ. εκτοξεύονται ως ασαφείς χαρακτηρισμοί που χρησιμοποιούνται για να παρακαμφθεί μια έννοια που είναι τόσο απλή και ευθεία που τα περισσότερα παιδιά μπορούν να την καταλάβουν. Κάτι είναι είτε καθαρό είτε ακάθαρτο. Δεν υπάρχει ενδιάμεσο.
Το ζήτημα του καθαρισμού είναι απολύτως ζωτικής σημασίας για τα θεμελιώδη προβλήματα σχετικά με την ιολογία. Προκειμένου να αποδειχθεί η ίδια η ύπαρξη των φανταστικών δημιουργημάτων που υποτίθεται ότι φοβόμαστε, πρέπει να αποδειχθεί ότι οι "ιοί" υπάρχουν σε καθαρή και απομονωμένη κατάσταση. Ωστόσο, ο καθαρισμός αγνοείται ως επί το πλείστον σε κάθε πρωτότυπη μελέτη "ιών", ενώ θα έπρεπε να αποτελεί εξέχουσα εστίαση. Αν θέλουμε να πιστέψουμε ότι υπάρχουν αυτές οι αόρατες ενδοκυτταρικές παρασιτικές οντότητες, πρέπει να είμαστε σε θέση να τις παρατηρήσουμε μόνες τους. Καθώς δεν μπορούμε να παρατηρήσουμε τους "ιούς" στη φύση ούτε με τα ίδια μας τα μάτια, αυτό σημαίνει ότι είναι απαραίτητο τα σωματίδια που υποτίθεται ότι είναι "ιοί" να λαμβάνονται απευθείας από τα υγρά ενός άρρωστου ανθρώπου και στη συνέχεια να καθαρίζονται απαλλαγμένα από οποιουσδήποτε μολυσματικούς παράγοντες, ρύπους, ξένα υλικά κ.λπ. που περιέχονται σε αυτά, έτσι ώστε να μην απομένει τίποτε άλλο εκτός από τα υποτιθέμενα "ιϊκά" σωματίδια. Μόνο τότε θα μπορούσε να αποδειχθεί η παθογένεια με την ύπαρξη μιας έγκυρης ανεξάρτητης μεταβλητής που θα διαχωριζόταν από οτιδήποτε άλλο, προκειμένου να διαπιστωθεί μια σχέση αιτίου-αποτελέσματος για τα σωματίδια που ισχυρίζονται ως ο αιτιολογικός παράγοντας. Μόνο τότε θα ήταν έγκυρες ως αποδεικτικά στοιχεία οι εικόνες από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μόνο αυτών των σωματιδίων χωρίς τίποτε άλλο που περιέχεται στο δείγμα.
Ωστόσο, όπως θα δείτε, οι ιολόγοι έχουν παραδεχθεί πολλές φορές ότι οι "ιοί" δεν μπορούν να καθαριστούν και να απομονωθούν απευθείας από τα υγρά ενός άρρωστου ανθρώπου. Δηλώνουν ότι οι "ιοί" πρέπει πρώτα να καλλιεργηθούν με ένα κύτταρο ξενιστή πριν από τον καθαρισμό και την απομόνωση. Αυτό δημιουργεί πολλά προβλήματα, όπως:
Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό και την απομόνωση των "ιών" είναι αναποτελεσματικές
Οι "ιοί" δεν μπορούν να διαχωριστούν από τα εξωσώματα και άλλα MVB εντός του δείγματος
Η μέθοδος κυτταροκαλλιέργειας είναι ακάθαρτη και τα μέσα και το DNA των κυττάρων-ξενιστών δεν μπορούν να καθαριστούν από τους αόρατους "ιούς"
Σε αυτό το άρθρο, θα αναλύσω αυτά τα διάφορα προβλήματα και θα δείξω ότι, από τις δικές τους πηγές, η ιολογία παραδέχεται ότι ο πλήρης καθαρισμός και η απομόνωση των υποτιθέμενων "ιικών" σωματιδίων είναι αδύνατη.
-- Αναποτελεσματικές Μέθοδοι
Ένα μεγάλο εμπόδιο για την απόκτηση αποδείξεων καθαρισμού των σωματιδίων που θεωρούνται "ιοί" είναι ότι δεν υπάρχει τυποποιημένη καθολική μέθοδος καθαρισμού. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται διαφέρουν ανάλογα με τον "ιό" και τους ερευνητές που διεξάγουν τη μελέτη. Αυτό που "δουλεύει" για έναν "ιό" μπορεί να μην δουλεύει για έναν άλλο, όπως σημειώνεται σε αυτή την πηγή σχετικά με τον καθαρισμό φυτικών "ιών":"
"Ο καθαρισμός αναφέρεται στον διαχωρισμό των σωματιδίων του ιού από τα συστατικά του ξενιστή σε βιολογικά ενεργή κατάσταση. Ο καθαρισμένος ιός απαιτείται για την παραγωγή αντισωμάτων, τον φυσικό, βιοχημικό και μοριακό χαρακτηρισμό απομονωμένων ιών. Ο καθαρισμός του ιού περιλαμβάνει διάφορα στάδια, όπως ο πολλαπλασιασμός του ιού στον ξενιστή, η εκχύλιση του χυμού, η διαύγαση, η συγκέντρωση και ο περαιτέρω καθαρισμός. Η καθαρότητα του καθαρισμένου παρασκευάσματος μπορεί να ελεγχθεί μέσω φασμάτων απορρόφησης UV και η μολυσματικότητά του με εμβολιασμό σε ευαίσθητο ξενιστή υπό βέλτιστες περιβαλλοντικές συνθήκες σε θερμοκήπιο με προστασία από έντομα. Οι μέθοδοι καθαρισμού ποικίλλουν ανάλογα με τους διάφορους ιούς και δεν υπάρχουν καθολικές μέθοδοι καθαρισμού ιών. Οι διαδικασίες που είναι αποτελεσματικές για έναν ιό μπορεί να μην λειτουργούν με τον άλλο".
https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-0716-0334-5_21
Τα ζητήματα που σχετίζονται με την έλλειψη τυποποιημένων μεθόδων ή διαδικασιών για την επίτευξη καθαρισμού περιπλέκονται από την ύπαρξη διαφόρων μεθόδων που μπορούν να επιλέξουν οι ιολόγοι προκειμένου να προσπαθήσουν να επιτύχουν καθαρισμό. Αυτές περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τις εξής:
Φυγοκέντρηση
Διήθηση
Κατακρήμνιση
Χρωματογραφία
Προσρόφηση
Ωστόσο, θα δυσκολευτείτε να βρείτε πολλές αναφορές για οποιαδήποτε από αυτές τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται σε μελέτες "ιών". Αν τύχει να βρείτε μεθόδους καθαρισμού να εκτελούνται, συνήθως πρόκειται απλώς για μια περιστροφή της παλιάς φυγοκέντρησης για λίγο. Ενώ αυτό μπορεί να διαχωρίσει ορισμένες από τις μεγαλύτερες ουσίες από τις μικρότερες, δεν προσφέρει πλήρη καθαρισμό όλων των σωματιδίων.
-- "Ιοί"/Εξωσωμάτια: Αδιαχώριστα "ξαδέλφια"
"Πώς μπορούμε να είμαστε σίγουροι ότι απομονώνουμε και ποσοτικοποιούμε εξωκυτταρικά κυστίδια και όχι περιτυλιγμένους ιούς που υπάρχουν στο δείγμα; Ομοίως, πώς μπορούν οι ερευνητές των ιών να γνωρίζουν ότι δεν ανιχνεύουν κυστίδια παρόμοιου μεγέθους μη-ιϊκών κυστιδίων ή κενών φορέων κατά την παραγωγή εμβολίων;"
Μπορούμε εύκολα να διαπιστώσουμε ότι αυτή η έλλειψη πλήρους καθαρισμού ισχύει για όλες τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τους "ιούς", αν εξετάσουμε την έρευνα των εξωσωμάτων, καθώς μοιράζεται ακριβώς τις ίδιες διαδικασίες με αυτές που χρησιμοποιούνται στην ιολογία. Για όσους δεν γνωρίζουν, τα εξωσώματα είναι "ιοί" με όλη τη σημασία της λέξης. Μοιράζονται τα ίδια βιοχημικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά. Η κύρια διαφορά (πέρα από την ονομασία) είναι ότι τα εξωσώματα θεωρούνται "μη μολυσματικά" και θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στην ενδοκυτταρική επικοινωνία. Με άλλα λόγια, είναι ακριβώς τα ίδια σωματίδια με τους "ιούς", αλλά τους δόθηκαν διαφορετικά ονόματα και διαφορετικές λειτουργίες από τα "ιογενή" ξαδέλφια τους. Ευτυχώς, όπως σημείωσα προηγουμένως, χρησιμοποιούνται οι ίδιες μέθοδοι καθαρισμού για αυτά τα πανομοιότυπα σωματίδια. Εάν οι μέθοδοι καθαρισμού δεν είναι σε θέση να καθαρίσουν πλήρως τα εξωσώματα, το ίδιο μπορεί να ειπωθεί και για τους "ιούς". Για παράδειγμα, σε αυτή τη μελέτη του 2020 σχετικά με τις προσπάθειες διαχωρισμού των "ιών" από τα εξωσώματα, βλέπουμε ότι η υπερφυγοκέντρηση, η "χρυσή μέθοδος" καθαρισμού και για τις δύο οντότητες, θεωρείται ανεπαρκής:
"Η μέθοδος δεν είναι ιδανικά κατάλληλη για τον διαχωρισμό των EV και των ιών, ιδίως από μολυσμένες καλλιέργειες ή/και σωματικά υγρά και είναι δύσκολο να υιοθετηθεί η υπερφυγοκέντρηση σε περιβάλλοντα παραγωγής μεγάλης κλίμακας ή σε περιβάλλοντα που παρουσιάζουν προβλήματα βιοασφάλειας".
https://link.springer.com/article/10.1007/s11481-019-09874-x
Αυτή η αδυναμία καθαρισμού των εξωσωμάτων από τους "ιούς" δεν σταματά με την υπερφυγοκέντρηση. Ανεξάρτητα από το ποια μέθοδος χρησιμοποιείται, η καθεμία έχει τα δικά της μειονεκτήματα και περιορισμούς που οδηγούν στην έλλειψη πλήρους καθαρισμού και στην αδυναμία διαχωρισμού των "ιών" από τα εξωσώματα. Αυτές οι δύο επόμενες πηγές δείχνουν ότι οι ίδιες μέθοδοι που μοιράζονται οι "ιοί" και τα εξωσώματα είναι όλες εξίσου ανίκανες να καθαρίσουν και να απομονώσουν επιτυχώς αυτά τα σωματίδια μεταξύ τους:
--Εξωσώματα και ιοί
"Λόγω των παρόμοιων φυσικών ιδιοτήτων τους, οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται από τους ερευνητές για τον καθαρισμό των εξωσωμάτων και των ιών είναι επίσης παρόμοιες.
Η υπερφυγοκέντρηση σε τιμές μεγαλύτερες από 100.000 x g χρησιμοποιείται για τη συγκέντρωση τόσο των εξωσωμάτων όσο και των ιών. Η τεχνική αυτή διατηρεί άθικτους, λειτουργικούς ιούς και εξωσώματα. Επειδή τα εξωσώματα και οι ιοί είναι παρόμοια σε μέγεθος και πυκνότητα, ο διαχωρισμός των δύο δεν είναι δυνατός με τη χρήση αυτής της τεχνικής.
Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την καταβύθιση τόσο των εξωσωμάτων όσο και των ιικών σωματιδίων. Η καταβύθιση PEG χρησιμοποιείται συνήθως στα διαθέσιμα στο εμπόριο κιτ απομόνωσης εξωσωμάτων και έχει αξιοποιηθεί για την απομόνωση πολλών διαφορετικών ιών εδώ και πολλά χρόνια. Και πάλι, δεν μπορείτε να διαχωρίσετε τους ιούς και τα εξωσώματα με αυτό το πρωτόκολλο.
Τα εξωσώματα και οι ιοί μπορούν επίσης να καθαριστούν χρησιμοποιώντας τεχνικές χρωματογραφίας με βάση το μέγεθος, τη συγγένεια, την υδροφοβικότητα ή άλλα χαρακτηριστικά. Ο καθαρισμός με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC), όπως το Exo-spin, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση τόσο των εξωσωμάτων όσο και των ιικών σωματιδίων. Και πάλι, τα εξωσώματα και τα ιικά σωματίδια δεν μπορούν να διακριθούν μεταξύ τους με τη χρήση αυτής της μεθόδου".
https://www.cellgs.com/blog/exosomes-and-viruses.html
-- Ανασκόπηση στρατηγικών και τεχνολογιών για την απομόνωση και τον καθαρισμό εξωσωμάτων
"Μια μέθοδος που μπορεί να παρέχει αποτελεσματικά άθικτα και καθαρά δείγματα εξωσωμάτων είναι το πρώτο βήμα τόσο για τις υγρές βιοψίες με βάση τα εξωσώματα όσο και για τα θεραπευτικά προϊόντα. Δυστυχώς, οι συνήθεις τεχνικές διαχωρισμού εξωσωμάτων πάσχουν από πολυπλοκότητα λειτουργίας, χρονοβόρες διαδικασίες, μεγάλους όγκους δειγμάτων και χαμηλή καθαρότητα, θέτοντας σημαντικές προκλήσεις για την ανάλυση των εξωσωμάτων στη συνέχεια".
"Επί του παρόντος, οι κοινές τεχνολογίες απομόνωσης εξωσωμάτων, όπως η υπερδιήθηση, η ανοσοαπομόνωση, η υπερφυγοκέντρηση ("χρυσός κανόνας" για την απομόνωση των εξωσωμάτων) είναι ακριβά όργανα, μεγάλοι όγκοι δείγματος, πιθανή πρωτεϊνική επιμόλυνση, πλήρη στάδια απομόνωσης, αλλά οδηγούν σε χαμηλή απόδοση απομόνωσης, απώλεια δείγματος, χαμηλή ανάκτηση και καθαρότητα εξωσωμάτων (LeBleu and Kalluri, 2020)".
"Αν και τα εξωσώματα διαδραματίζουν αναντικατάστατο ρόλο στην έγκαιρη ανίχνευση και θεραπεία, είναι μικρά σε μέγεθος (30-150 nm), χαμηλής πυκνότητας (1,13-1,19 g/ml) και αναμειγνύονται με παρόμοια συστατικά (π.χ. κυτταρικά θραύσματα, πρωτεΐνες) στα σωματικά υγρά, γεγονός που δημιουργεί τεράστιες προκλήσεις για τον διαχωρισμό τους (Cui et al., 2018; Lin et al., 2020). Επιπλέον, η βιολογική δραστηριότητα των εξωσωμάτων θα επηρεαστεί από τις διαφορετικές τεχνικές διαχωρισμού (Paolini et al., 2016)".
"Αν και οι προαναφερθείσες παραδοσιακές μέθοδοι διαχωρισμού είναι οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες, υπάρχουν επίσης πολλά μειονεκτήματα, όπως η μεγάλη κατανάλωση δείγματος, ο κίνδυνος βλάβης των εξωσωμάτων, η χαμηλή καθαρότητα και η μεγάλη χρονική διάρκεια, τα οποία είναι δύσκολο να ανταποκριθούν στις τρέχουσες αυξανόμενες επιστημονικές ερευνητικές ανάγκες."
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8766409/
Όπως γίνεται αντιληπτό, οι μέθοδοι που αναφέρονται παραπάνω δεν προσφέρουν τη δυνατότητα πραγματικού διαχωρισμού των σωματιδίων που πιστεύεται ότι είναι εξωσώματα από εκείνα που πιστεύεται ότι είναι "ιοί". Αυτό είναι ένα σημαντικό πρόβλημα, καθώς ο καθαρισμός είναι απολύτως απαραίτητος όχι μόνο για να αποδειχθεί η αιτία και το αποτέλεσμα αλλά και για να χαρακτηριστεί ο "ιός" φυσικά, μοριακά και βιοχημικά. Χωρίς να υπάρχουν μόνο τα υποτιθέμενα "ιικά" σωματίδια και μόνο, ο "ιός" δεν μπορεί να μελετηθεί ανεξάρτητα ούτε να διαφοροποιηθεί από τα εκατομμύρια παρόμοια ή/και πανομοιότυπα σωματίδια εντός του δείγματος. Δεν μπορεί να υπάρξει άμεση απόδειξη για την ύπαρξη οποιουδήποτε "ιού", καθώς υπάρχουν πολυάριθμοι άλλοι μικροοργανισμοί, ουσίες και μολυσματικοί παράγοντες μέσα σε ένα δείγμα που θα μπορούσαν επίσης να είναι η πιθανή αιτία της νόσου αντί για τον υποτιθέμενο -ακόμη- "ιό". Η βιβλιογραφία των εξωσωμάτων βρίθει από έγγραφα που εξηγούν την αδυναμία διαχωρισμού αυτών των σωματιδίων από τα "ιικά" ξαδέλφια τους. Καθώς τα εξωσώματα και οι "ιοί" έχουν το ίδιο μέγεθος και σχήμα, αυτό σημαίνει ότι ο πλήρης καθαρισμός και η απομόνωση οποιουδήποτε "ιού" είναι αδύνατη. Πάντα θα παραμένουν εξωσώματα ή/και οποιοδήποτε άλλο σωματίδιο που έχει το ίδιο μέγεθος ή είναι μικρότερο από τα υποτιθέμενα σωματίδια "ιού". Σημεία από το παρακάτω άρθρο από το 2019 παρουσιάζουν περαιτέρω στοιχεία προς αυτή την κατεύθυνση:
-- Πώς απομονώνονται τα εξωσώματα;
"Τα εξωσώματα είναι εξωκυτταρικά κυστίδια που πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων μεταφέροντας υλικά στο εσωτερικό του κυστιδίου.
-- Καθαρισμός (Purification)
Τα εξωσώματα μπορούν να απομονωθούν από κύτταρα χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους καθαρισμού κυτταρικών κλασμάτων. Η πρόκληση στην απομόνωση των κυστιδίων είναι η διαφοροποίησή τους από άλλους τύπους μεμβρανικού υλικού στο υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας.
Αυτό επιτυγχάνεται μέσω διαδοχικών βημάτων φυγοκέντρησης σε αυξανόμενες ταχύτητες. Το τελικό υπερκείμενο υγρό υπερφυγοκεντρείται σε υπερφυγοκέντρηση στα 100.000g για να διαχωριστούν τα εξωσώματα. Στη συνέχεια πλένεται για την απομάκρυνση των μολυσματικών πρωτεϊνών και φυγοκεντρείται σε υψηλή ταχύτητα άλλη μια φορά.
Ωστόσο, αυτός ο τύπος προετοιμασίας αποτελεί περισσότερο εμπλουτισμό του δείγματος παρά καθαρισμό. Απαιτείται ακόμη περαιτέρω ανάλυση του δείγματος μέσω βιοχημείας ή μικροσκοπίας για τον χαρακτηρισμό των κυστιδίων.
--Χαρακτηρισμός (Characterization)
Εκτός από τα εξωσωμάτια, το εξωκυττάριο περιβάλλον περιέχει εξωκυττάριο RNA, άλλους τύπους κυστιδίων, πρωτεϊνικά σύμπλοκα και λιποπρωτεΐνες. Αυτά δεν διαχωρίζονται πλήρως από τα εξωσώματα μέσω του πρωτοκόλλου φυγοκέντρησης. Υπάρχουν επίσης διαθέσιμα εμπορικά κιτ για την απομόνωση των εξωσωμάτων που κάνουν χρήση πολυμερών, αλλά αυτά τα κιτ τείνουν να συν-απομονώνουν άλλα μόρια, ιδίως σύμπλοκα RNA-πρωτεΐνης.
Η Εκτελεστική Επιτροπή της Διεθνούς Εταιρείας Εξωκυττάριων Σωληναρίων (ISEV) πρότεινε κριτήρια για τον χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων ώστε να βοηθηθεί η αποτελούμενη αναφορά των πειραματικών αποτελεσμάτων.
Τα κριτήρια που πρέπει να τηρούν όλα τα δείγματα εξωσωμάτων παρατίθενται παρακάτω:
Να απομονώνονται από εξωκυτταρικά υγρά, όπως μέσο κυτταροκαλλιέργειας ή σωματικά υγρά. Η συλλογή πρέπει να είναι ήπια ώστε να ελαχιστοποιείται η διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος που θα μπορούσε να επιμολύνει το δείγμα με ενδοκυτταρικά διαμερίσματα.
Να περιλαμβάνεται στην περιγραφή του μια επισκόπηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η ποσότητα 3 ή περισσότερων σχετικών πρωτεϊνών θα πρέπει να αναφέρεται με ημιποσοτικό τρόπο σε κάθε παρασκεύασμα εξωσώματος.
Να έχουν επίπεδα πρωτεϊνών που δεν αναμένεται να εμπλουτιστούν για να προσδιοριστεί ο βαθμός συν-απομόνωσης ενδοκυτταρικών κυστιδίων.
Να χαρακτηρίζονται μεμονωμένα κυστίδια ως ένδειξη ετερογένειας.
Να διαθέτουν ποσοτική ανάλυση των σχέσεων δόσης-λειτουργίας στην περίπτωση που διεξάγονται in vitro λειτουργικές μελέτες.
Να αποδεικνύεται η συσχέτιση μορίων με το εξώσωμα, στην περίπτωση που οι λειτουργικές αλλαγές αποδίδονται σε μεμονωμένα μόρια ή ομάδες μορίων.
Η μελέτη των εξωσωμάτων αποτελεί πλούσιο πεδίο έρευνας λόγω του μεγάλου αριθμού αναπάντητων ερωτημάτων, όπως ο ακριβής τρόπος σχηματισμού τους, οι λειτουργίες τους, ο τρόπος επικοινωνίας τους με τα κύτταρα-δέκτες και ο ρόλος τους σε διάφορες ασθένειες.
Απαιτούνται συνεπείς μέθοδοι για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων και τη διάκρισή τους από άλλους τύπους εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων κυστιδίων, ώστε να καταστεί δυνατή η επίτευξη αυτών των εξελίξεων".
https://www.news-medical.net/amp/life-sciences/How-are-Exosomes-Isolated.aspx
Δεν υπάρχουν σταθερές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό (δηλαδή την "απομόνωση") των εξωσωμάτων ούτε τρόποι για τη διάκρισή τους από άλλους εξωκυτταρικούς και ενδοκυτταρικούς οργανισμούς. Με άλλα λόγια, τα εξωσώματα (ο "μη μολυσματικός ιός") δεν μπορούν να διαχωριστούν πλήρως από οτιδήποτε άλλο ούτε μπορούν να διαφοροποιηθούν από οτιδήποτε άλλο μέσα στο υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας. Αυτό θα πρέπει να σας πει όλα όσα πρέπει να γνωρίζετε σχετικά με την αδυναμία πλήρους καθαρισμού και απομόνωσης αυτών των οντοτήτων.
--Καθαρισμός "ιών" από καλλιέργεια για εμβόλια;
Πέρα από την αδυναμία πλήρους καθαρισμού και απομόνωσης των εξωσωμάτων (βήχα "ιών" βήχα) από οτιδήποτε περιέχεται σε ένα δείγμα, είναι επίσης παραδεκτό ότι οι "ιοί" δεν μπορούν να καθαριστούν πλήρως από τα υλικά κυτταροκαλλιέργειας στα οποία υποτίθεται ότι αναπτύσσονται. Πάρτε, για παράδειγμα, το εμβόλιο Jynneos για την ευλογιά των πιθήκων. Υποστηρίζεται ότι το εμβόλιο, το οποίο χρησιμοποίησε ινοβλαστικά κύτταρα εμβρύου κοτόπουλου για την καλλιέργεια του υποτιθέμενου "ιού", ήταν καθαρισμένο και ότι δεν περιείχε κανένα ζωικό υλικό. Ωστόσο, αργότερα αποκαλύπτεται στην ίδια παράγραφο ότι το εμβόλιο όχι μόνο περιέχει DNA ξενιστή (δηλαδή DNA κοτόπουλου από το κύτταρο CEF), αλλά περιέχει και άλλες πρωτεΐνες (άγνωστης προέλευσης), καθώς και αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν για την καλλιέργεια και ένα ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό:
Βενζονάση - μια γενετικά τροποποιημένη ενδονουκλεάση από Serratia marcescens που παράγεται και "καθαρίζεται" από στέλεχος E. coli
Γενταμικίνη - ένα αντιβιοτικό που μπορεί να προκαλέσει σοβαρή βλάβη στα νεφρά
Σιπροφλοξασίνη - ένα άλλο αντιβιοτικό που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία βακτηριακών λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος
"Το JYNNEOS είναι ένα ζωντανό εμβόλιο που παράγεται από το στέλεχος Modified Vaccinia Ankara-Bavarian Nordic (MVA-BN), έναν εξασθενημένο, μη αναπαραγόμενο ορθοπυξινόβιο. Το MVA-BN αναπτύσσεται σε πρωτογενή κύτταρα ινοβλαστών εμβρύου κοτόπουλου (CEF) που αιωρούνται σε μέσο χωρίς ορό που δεν περιέχει υλικό άμεσης ζωικής προέλευσης, συλλέγεται από τα κύτταρα CEF, καθαρίζεται και συμπυκνώνεται με διάφορα στάδια διήθησης εφαπτομενικής ροής (TFF), συμπεριλαμβανομένης της πέψης με βενζονάση. Κάθε δόση των 0,5 ml είναι διαμορφωμένη ώστε να περιέχει 0,5 x 108 έως 3,95 x 108 μολυσματικές μονάδες ζωντανού ιού MVA-BN σε 10 mM Tris (τρομεθαμίνη), 140 mM χλωριούχο νάτριο σε pH 7,7. Κάθε δόση 0,5 ml μπορεί να περιέχει υπολειμματικές ποσότητες DNA κυττάρων ξενιστών (≤ 20 mcg), πρωτεΐνης (≤ 500 mcg), βενζονάσης (≤ 0,0025 mcg), γενταμυκίνης (≤ 0,163 mcg) και σιπροφλοξασίνης (≤ 0,005 mcg)."
2520οι%2520τρεις%2520μελέτες%252C%
2520solicited,JYNNEOS%2520ήταν%2520καταπόνηση%2520(33,5%2525)%252C&ved=2ahUKEwjEh9Co_Pv3AhVzBTQIHUerABcQFnoECBAQBg&usg=AOvVaw3J3c6aEzZqhhCAwK9cA-nS
Αυτό παρατηρείται επίσης στο εμβόλιο "Covid" της Johnson & Johnson, το οποίο περιέχει ίχνη DNA ξενιστή που ανήκουν στην κυτταρική σειρά PER.C6 TetR που προέρχεται από ανθρώπινα εμβρυϊκά κύτταρα αμφιβληστροειδούς από ένα έκτρωμα εμβρύου που υποτίθεται ότι έχει τροποποιηθεί γενετικά με "αδενοϊό". Αυτή η κυτταρική σειρά είναι γνωστό ότι προκαλεί όγκους σε ποντίκια:
"Ο φορέας Ad26 που εκφράζει την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S αναπτύσσεται σε κύτταρα PER.C6 TetR, σε μέσο που περιέχει αμινοξέα και όχι πρωτεΐνες ζωικής προέλευσης. Μετά τον πολλαπλασιασμό, το εμβόλιο επεξεργασία μέσω διαφόρων σταδίων καθαρισμού, διαμορφώνεται με ανενεργά συστατικά και γεμίζεται σε φιαλίδια.
Κάθε δόση 0,5 ml του εμβολίου Janssen COVID-19 είναι διαμορφωμένη ώστε να περιέχει 5×10^10 σωματίδια ιού (VP) και τα ακόλουθα ανενεργά συστατικά: μονοϋδρικό κιτρικό οξύ (0,14 mg), διυδρικό κιτρικό τρισόξινο (2,02 mg), αιθανόλη (2,04 mg), 2-υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (HBCD) (25,50 mg), πολυσορβικό-80 (0,16 mg), χλωριούχο νάτριο (2,19 mg). Κάθε δόση μπορεί επίσης να περιέχει υπολειμματικές ποσότητες πρωτεϊνών κυττάρων ξενιστών (≤0,15 mcg) και/ή DNA κυττάρων ξενιστών (≤3 ng)".
Κάντε κλικ για να αποκτήσετε πρόσβαση στο Janssen+COVID-19+Vaccine-HCP-fact-sheet.pdf
Θυμηθείτε, καθαρισμός σημαίνει απαλλαγή από μολυσματικές ουσίες, ρύπους, ξένα υλικά κ.λπ. Σας φαίνονται αυτά τα εμβόλια σαν καθαρισμένα παρασκευάσματα; Αν δεν μπορούν να διαχωρίσουν τα πρόσθετα της κυτταροκαλλιέργειας καθώς και την ουσία βενζονάση που χρησιμοποιείται για τον "καθαρισμό" όπως στο εμβόλιο Jynneos, πώς μπορούν να καθαρίσουν έναν "ιό" για να μελετήσουν την αιτία και το αποτέλεσμα, πόσο μάλλον για χρήση σε εμβόλιο; Εάν δεν μπορούν να διαχωρίσουν το DNA του κυττάρου ξενιστή, όπως σημειώνεται και στα δύο εμβόλια, όποια κυτταρική σειρά και αν χρησιμοποιήσουν, από καρκινικά κύτταρα μέχρι αμβλωμένα έμβρυα και νεφρά πιθήκων, θα παραμείνει μέσα στο εμβόλιο και θα εγχυθεί στο σώμα. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο είναι επιτακτική ανάγκη να είναι σε θέση να αποδείξουν ότι αυτά τα υποτιθέμενα σωματίδια "ιού" υπάρχουν απευθείας στα υγρά ενός δείγματος από έναν άρρωστο άνθρωπο πρώτα, πριν αυτό υποβληθεί στη διαδικασία της κυτταροκαλλιέργειας και αναμιχθεί με κάθε είδους εξωτερικές προσμίξεις και ξένα υλικά που στη συνέχεια δεν είναι σε θέση να καθαριστούν από τα υποτιθέμενα σωματίδια "ιού".
Μπορούμε να αποκτήσουμε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την αδυναμία διαχωρισμού του "ιού" από τα υλικά καλλιέργειας σε αυτά τα στιγμιότυπα από ένα εγχειρίδιο καθαρισμού "ιού" 270 σελίδων:
-- ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ, ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΙΩΝ
"Κατά την παρασκευή εμβολίων, η κυτταρική καλλιέργεια συνοδεύεται συνήθως από κυτταρικά υπολείμματα, ανεπιθύμητες πρωτεΐνες του μέσου, τυχαίους παράγοντες, υπολείμματα DNA, νουκλεϊκά οξέα και πολλές εκπλυόμενες προσμίξεις που σχετίζονται με τη διαδικασία. Σύμφωνα με τον FDA η έγκριση εμβολίων απαιτεί την απαλλαγή από ξένα υλικά, είτε είναι επιβλαβή είτε όχι για τον παραλήπτη [12]. Οι ιοί έχουν μοναδικό μέγεθος, σχήμα και επιφανειακή χημεία, δηλαδή υδροφοβικότητα και φορτίο. Τις περισσότερες φορές απαιτείται μια σειρά μοναδιαίων λειτουργιών για την αύξηση της απόδοσης των σωματιδίων του ιού. Οι λειτουργίες που χρησιμοποιούνται σήμερα περιλαμβάνουν συνδυασμό καταβύθισης, φυγοκέντρησης, διήθησης και χρωματογραφίας [13, 14]".
"Η παραγωγή εμβολίων στη θεραπευτική βιομηχανία πραγματοποιείται επί του παρόντος κατά περίπτωση για κάθε ιό και εξακολουθεί να λείπει ένα ενιαίο σύστημα πλατφόρμας για τον καθαρισμό των ιών. Ένα παραδοσιακό σύστημα ATPS χρησιμοποιήθηκε για την καταβύθιση του ιού, αλλά η έλλειψη εκλεκτικότητας για τον ιό έναντι των πρωτεϊνικών προσμίξεων και η δυσκολία διαχωρισμού από την πολυμερή φάση ανέστειλαν την πρόοδο του ATPS προς τα συστήματα ανάπτυξης εμβολίων".
"Παραδοσιακά, ο ιός καθαρίζεται με υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδες χλωριούχου καισίου (CsCl) ή σακχαρόζης [10, 11]. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι η διατμητική δύναμη μειώνει τη μολυσματικότητα του ιού και επιπλέον είναι χρονοβόρα, ενεργοβόρα και δύσκολα επεκτάσιμη [12]. Η καταβύθιση του ιού με μέτρια αποτελέσματα έχει επιτευχθεί με τη χρήση αλάτων θειικού αμμωνίου [13] ή φωσφορικού ασβεστίου [14]. Το σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG)/υδατικό σύστημα δύο φάσεων έχει επίσης μελετηθεί για τον καθαρισμό του ιού [15], αλλά η τεχνική δεν έχει την ικανότητα να καθαρίζει τον ιό από πολλές προσμίξεις κυτταροκαλλιεργειών.
Η χρωματογραφία μια δημοφιλής τεχνική για τον καθαρισμό βιομορίων έχει χρησιμοποιηθεί σπάνια για την ανάκτηση ιών λόγω των περιορισμών διάχυσης και του μεγάλου μεγέθους του ιού, που περιορίζουν την πρόσβαση στην εσωτερική επιφάνεια των σφαιριδίων. Η τεχνική δεν έχει προσφέρει υψηλή απόδοση ιού, αλλά είναι γνωστό ότι λειτουργεί καλά για πρωτεϊνικά βιομόρια μεγέθους < 5 nm [16]. Η χρωματογραφία έχει κερδίσει ευρεία προσοχή λόγω της ικανότητάς της να δημιουργεί εξειδίκευση για ένα βιομόριο με βάση διάφορες μεταβλητές όπως το φορτίο, το μέγεθος και η υδροφοβικότητα [17-19]. Ο ιός που παράγεται στο εργαστήριο είναι σε μεγάλο βαθμό μολυσμένος με πρωτεΐνες του κυτταρικού μέσου και στόχος μας είναι να εξετάσουμε κάθε μεταβλητή ξεχωριστά (φορτίο, μέγεθος και υδροφοβικότητα) για τη μέγιστη δυνατή απομάκρυνση των πρωτεϊνών με την καλύτερη δυνατή ανάκτηση του ιού. Ο καθαρισμένος ιός μπορεί να είναι πολύ χρήσιμος για την ανάλυση των κυτταρικών πρωτεϊνών και της παρεμβολής των μολυσματικών ουσιών κατά τη διάρκεια πειραμάτων εργαστηριακής κλίμακας".
"Ο καθαρισμός του ιού πραγματοποιείται συνήθως από φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας ή τεχνικές καθίζησης αλάτων ή πολυμερών. Οι μέθοδοι είναι δύσκολο να κλιμακωθούν ή στερούνται εξειδίκευσης από τη συν-κατακρήμνιση προσμίξεων. Η διήθηση είναι μια άλλη τεχνική για τον καθαρισμό του ιού, αλλά αυτή μπορεί να προκαλέσει υποβάθμιση του ιού από τη διατμητική τάση, ιδίως σε συνθήκες διήθησης εφαπτομενικής ροής. Απαιτείται ένα αποτελεσματικό και γρήγορο σύστημα για την επίτευξη ιού υψηλής καθαρότητας".
Θα πρέπει να είναι σαφές από τα παραπάνω αποσπάσματα ότι είναι αδύνατο να καθαριστούν οι "ιοί" από το υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας και το υλικό που χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό. Αυτό θα πρέπει να είναι το τελευταίο καρφί στο φέρετρο τόσο για την κυτταροκαλλιέργεια όσο και για την ιολογία, καθώς έχει παραδεχθεί πολλές φορές ότι ο μόνος τρόπος με τον οποίο οι ιολόγοι μπορούν να "απομονώσουν" έναν "ιό" είναι μέσω της κυτταροκαλλιέργειας.
Από την αναπληρώτρια καθηγήτρια και μικροβιολόγο του Πανεπιστημίου του Όκλαντ Siouxsie Wiles σε έναν έλεγχο "γεγονότων" του AAP:
"Οι ιοί είναι βασικά άψυχα αντικείμενα τα οποία χρειάζονται μια καλλιέργεια για να ενεργοποιηθούν. Αλλά ο τρόπος με τον οποίο διατυπώνουν τα αιτήματα είναι ότι το δείγμα πρέπει να είναι εντελώς ανόθευτο και να μην έχει καλλιεργηθεί σε καμία καλλιέργεια - και δεν μπορείτε να το κάνετε αυτό", δήλωσε η ίδια στο AAP FactCheck σε τηλεφωνική συνέντευξη.
"Δεν μπορείτε να απομονώσετε έναν ιό χωρίς να χρησιμοποιήσετε μια κυτταρική καλλιέργεια, οπότε σύμφωνα με τον ορισμό τους δεν έχει απομονωθεί. Όμως έχει απομονωθεί και καλλιεργηθεί με τη χρήση κυτταρικής καλλιέργειας πολλές φορές σε όλο τον κόσμο".
https://viroliegy.com/2021/09/19/what-do-virologists-mean-by-isolation/
Από το CDC:
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την αδυναμία καθαρισμού του "ιού" από το υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας, ας δούμε την Καθοδήγηση του FDA για τη Βιομηχανία για τα εμβόλια, την οποία θα βρείτε παρακάτω. Ο FDA αναφέρει ότι οι ζωντανοί εξασθενημένοι "ιοί" δεν μπορούν να καθαριστούν τόσο αυστηρά όσο τα εμβόλια υπομονάδων (ένα εμβόλιο που περιέχει "καθαρισμένα" μέρη του παθογόνου που χρησιμοποιούνται για την πρόκληση ανοσολογικής απόκρισης), γεγονός που οδηγεί σε μεγαλύτερη μόλυνση. Εξαιτίας αυτού, δεν είναι δυνατόν να επικυρωθεί η απομάκρυνση των τυχαίων παραγόντων στα εμβόλια με ζωντανούς "ιούς", πράγμα που σημαίνει ότι ο καθαρισμός είναι αδύνατος. Για τα αδρανοποιημένα εμβόλια "ιού", υπάρχει η πιθανότητα να μην έχουν αδρανοποιηθεί όλοι οι τυχαίοι παράγοντες, όπως παρατηρήθηκε στην περίπτωση του εμβολίου πολιομυελίτιδας.
Ο FDA παραδέχεται πολυάριθμες πηγές μόλυνσης μόνο από την ίδια τη διαδικασία καλλιέργειας κυττάρων, όπως:
Έκθεση στο άτομο ή στο ζώο από το οποίο "απομονώθηκε" ο "ιός".
Τα κύτταρα και οι πρώτες ύλες (π.χ. ορός ή θρυψίνη) που χρησιμοποιήθηκαν
Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην τράπεζα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για την ανάπτυξη "ιικού" σπόρου
Άλλα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν κατά την παραγωγή και το γέμισμα του σπόρου
Τυχόν μολυσματικοί "ιοί" (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μολύνουν μη ανθρώπινα είδη)
Ρετροϊοί που μπορεί να είναι είτε ενδογενείς (προερχόμενοι από το εσωτερικό του ξενιστή) είτε εξωγενώς αποκτηθέντες
Ο κατάλογος των πηγών μόλυνσης του FDA ορίζει ότι η καλλιέργεια του δείγματος ακυρώνει αμέσως κάθε ισχυρισμό καθαρότητας. Ακόμη και κατά τον έλεγχο για επιμόλυνση, ο FDA επιτρέπει τη χρήση καλλιεργειών "μη μολυσμένου ελέγχου" για να διαπιστωθεί αν η καλλιέργεια είναι απαλλαγμένη από επιμόλυνση ή όχι, αντί του ελέγχου της πραγματικής "μολυσμένης" καλλιέργειας που θα χρησιμοποιηθεί για το εμβόλιο. Αν και θα πρέπει να είναι προφανές ότι δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται μια παραπληρωματική καλλιέργεια για να κριθεί αν μια ξεχωριστή καλλιέργεια είναι απαλλαγμένη από μόλυνση ή όχι, οι συνθήκες που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια ελέγχου πρέπει απλώς να είναι παρόμοιες με τη "μολυσμένη" καλλιέργεια και όχι πανομοιότυπες, γεγονός που ακυρώνει αμέσως αυτή τη διαδικασία ως έλεγχο.
Παραδέχεται επίσης ο FDA ότι οι κυτταρικές σειρές, όπως τα κύτταρα Vero που χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια πολλών "ιών" (συμπεριλαμβανομένου του "SARS-COV-2"), έχουν βιοχημικά, βιολογικά και γενετικά χαρακτηριστικά που διαφέρουν από τις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές, οι οποίες μπορεί να είναι αποτέλεσμα μετασχηματισμού που προκαλείται από έναν τυχαίο παράγοντα. Μπορεί επίσης να υπάρχουν δυνητικοί κίνδυνοι από υπολείμματα DNA εντός του εμβολίου. Καθώς ο μηχανισμός με τον οποίο οι περισσότερες κυτταρικές σειρές γίνονται αθάνατες είναι άγνωστος και λόγω του γεγονότος ότι ορισμένες κυτταρικές σειρές προκαλούν όγκους σε εμβολιασμένα ποντίκια, υπάρχουν πολλές ανησυχίες με τη χρήση αυτών των κυτταρικών σειρών σε εμβόλια. Αυτό είναι ένα ακόμη παράδειγμα που δείχνει ότι ο πλήρης καθαρισμός των "ιών" που προέρχονται από αυτές τις κυτταρικές σειρές είναι αδύνατος.
Τέλος, παραδέχεται ο FDA ότι το κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα, το οποίο χρησιμοποιείται για να καθοριστεί αν υπάρχει ή όχι "ιός" στην καλλιέργεια, μπορεί στην πραγματικότητα να προκληθεί από ουσίες εκτός από "ιούς":" Προφανώς, εάν άλλοι παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν το ίδιο αποτέλεσμα που αποδίδεται σε έναν "ιό", δεν υπάρχει λόγος ο "ιός" να μπει στην εξίσωση ως πιθανή εξήγηση ως αιτία του αποτελέσματος, ιδίως όταν τα σωματίδια που θεωρούνται "ιοί" δεν είναι δυνατόν να παρατηρηθούν σε πλήρως καθαρισμένη και απομονωμένη κατάσταση χωρίς να προηγηθεί καλλιέργεια:
-- Χαρακτηρισμός και Πιστοποίηση Κυτταρικών Υποστρωμάτων και Άλλων Βιολογικών Υλικών που Χρησιμοποιούνται στην Παραγωγή Ιϊκών Εμβολίων για Λοιμώδεις Νόσους
"Οι ζωντανοί εξασθενημένοι ιοί, τα ολόκληρα αδρανοποιημένα ιόντα ή τα ιόμορφα σωματίδια συχνά δεν μπορούν να καθαριστούν τόσο αυστηρά όσο τα εμβόλια υπομονάδων ιών- κατά συνέπεια, η πιθανότητα μόλυνσης είναι μεγαλύτερη από εκείνη των εμβολίων υπομονάδων. Παραγωγή
ζωντανών ιικών εμβολίων περιλαμβάνει συχνά κυτταρική διάσπαση, η οποία μπορεί να προσθέσει κυτταρικά συστατικά στον όγκο του εμβολίου. Επιπλέον, τα εμβόλια αυτά συχνά καθαρίζονται ελάχιστα και δεν υποβάλλονται σε στάδια αδρανοποίησης. Η ολοκληρωμένη δοκιμή και η πιστοποίηση των βιολογικών αρχικών υλικών και η δοκιμή παρτίδας προς παρτίδα για τυχαίους παράγοντες είναι ιδιαίτερα σημαντικές, διότι ο παρασκευαστής εμβολίων με ζώντες ιούς δεν μπορεί να επικυρώσει τη διαδικασία για την απαλλαγή από τυχαίους παράγοντες.
Αντίθετα, για πιο υψηλά καθαρισμένα προϊόντα, όπου μπορεί να αποδειχθεί η απομάκρυνση του ιού κατά τη μεταγενέστερη επεξεργασία, μπορείτε να βασιστείτε περισσότερο στην επικύρωση της διαδικασίας (βλ. 2). Για τα αδρανοποιημένα εμβόλια, η ανησυχία είναι ότι η διαδικασία που χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση του ιού του εμβολίου μπορεί να μην αδρανοποιήσει όλους τους τυχαίους παράγοντες που ενδεχομένως υπάρχουν (όπως συνέβη με τα πρώιμα αδρανοποιημένα εμβόλια πολιοϊού [Αναφ. 4]). Επομένως, θα πρέπει να επικυρώσετε τη διαδικασία αδρανοποίησης των τυχαίων παραγόντων χρησιμοποιώντας διαφορετικούς ιούς-μοντέλα (βλ. 2). Η επιλογή των δοκιμών και τα στάδια στα οποία εφαρμόζονται οι δοκιμές εξαρτώνται από τη διαδικασία αδρανοποίησής σας. Ο βαθμός εκκαθάρισης των ιών που είναι εφικτός μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των δοκιμών που πρέπει να εκτελέσετε για να αποδείξετε την απουσία επιμολυντών στο προϊόν σας".
-- 2. Πιθανές Πηγές Μόλυνσης
"Είναι σημαντικό να εντοπίζετε και να εξετάζετε όλες τις πιθανές πηγές μόλυνσης του προϊόντος σας. Για παράδειγμα, ένας ιικός σπόρος θα μπορούσε να εκτεθεί στις ακόλουθες πιθανές πηγές μόλυνσης: το άτομο ή το ζώο από το οποίο απομονώθηκε- τα κύτταρα και οι πρώτες ύλες (π.χ. ορός ή θρυψίνη) που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση και την εξασθένησή του- τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την τράπεζα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για την ανάπτυξη ιϊκού σπόρου- και άλλα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν κατά την παραγωγή και την πλήρωση του σπόρου. Θα πρέπει επίσης να λαμβάνετε υπόψη τα είδη προέλευσης των κυτταρικών υποστρωμάτων, των ιϊκών σπόρων και άλλων βιολογικών αρχικών υλικών κατά την επιλογή των δοκιμών σας για να διασφαλίσετε την απουσία επιμολυντών. Επιπλέον, θα πρέπει να εξετάζετε τυχόν μολυσματικούς ιούς (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μολύνουν μη ανθρώπινα είδη) ως δυνητικούς μολυσματικούς παράγοντες εάν υπάρχει πιθανότητα επαφής με το προϊόν ή το κυτταρικό σας υπόστρωμα σε οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ή της παραγωγής. Οι ρετροϊοί μπορεί να είναι είτε ενδογενείς (δηλ. κωδικοποιημένοι από το γονιδίωμα του κυτταρικού υποστρώματος) είτε εξωγενώς αποκτηθέντες. Οι δοκιμές ρετροϊών θα πρέπει να εξετάζουν την πιθανότητα ότι οποιοσδήποτε τύπος ρετροϊού θα μπορούσε να μολύνει ένα προϊόν. Τέλος, θα πρέπει να εξετάσετε την πιθανότητα επιμόλυνσης από ασυνήθιστες πηγές, όπως για παράδειγμα η αναφερόμενη παρουσία του μικροσκοπικού ιού των ποντικών (MVM) σε ορισμένες παρτίδες ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (αναφορά 5). Η ευαισθησία του κυτταρικού υποστρώματος στη μόλυνση από παράγοντες δυνητικής ανησυχίας μπορεί να επηρεάσει τις δοκιμές που απαιτούνται για τη διασφάλιση της απουσίας μόλυνσης".
-- 4. Χρήση καλλιεργειών κυττάρων ελέγχου
"Συνιστούμε τη χρήση κυττάρων ελέγχου όταν δεν είναι εφικτή η απευθείας δοκιμή κυττάρων ή προϊόντος σε διάφορα στάδια της παρασκευής. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείτε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων για τον πολλαπλασιασμό του ιού του εμβολίου σας, η πλήρης δοκιμή της πρωτογενούς καλλιέργειας ενδέχεται να μην είναι εφικτή πριν από τον εμβολιασμό του ιού. Σε αυτή την περίπτωση, όταν είναι δυνατόν, θα πρέπει να παράγετε και να δοκιμάζετε μη μολυσμένες καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου που προέρχονται παράλληλα με την καλλιέργεια παραγωγής και αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο με αυτήν".
"Οι καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου θα πρέπει να πολλαπλασιάζονται υπό συνθήκες παρόμοιες με τις συνθήκες παραγωγής για χρονικό διάστημα κατάλληλο για τον λόγο εκτέλεσης των καλλιεργειών. Η χρονική αυτή περίοδος μπορεί να είναι 14 ημέρες ή και περισσότερο, όταν απαιτείται για να καταστεί δυνατή η ανίχνευση πιθανών τυχαίων παραγόντων που μπορεί να είναι λανθάνουσες, ενδογενείς ή ελάχιστα αναπαραγόμενες. Οι καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία ταυτόχρονα με την καλλιέργεια παραγωγής σας, αλλά να μην έχουν μολυνθεί. Τα κύτταρα ελέγχου θα πρέπει να αξιολογούνται για την παρουσία τυχαίων παραγόντων χρησιμοποιώντας τις ίδιες δοκιμές που θα εκτελούνταν στις καλλιέργειες παραγωγής, εάν αυτό ήταν εφικτό. Οι δοκιμές για τυχαίους παράγοντες θα πρέπει να εκτελούνται σε κύτταρα ελέγχου σε χρόνους κατά τους οποίους θα εκτελούσατε παρόμοιες δοκιμές στο παραγόμενο προϊόν σας".
-- 5. Ειδικές εκτιμήσεις για συνεχείς κυτταρικές γραμμές
"Ορισμένες συνεχείς κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Vero και των κυττάρων CHO, έχουν χρησιμοποιηθεί ως υποστρώματα για αδειοδοτημένους βιολογικούς παράγοντες. Οι κυτταρικές σειρές ενδέχεται να έχουν βιοχημικά, βιολογικά και γενετικά χαρακτηριστικά που διαφέρουν από τα πρωτογενή ή διπλοειδή κύτταρα (π.χ. είναι συνήθως ανευπλοειδή και έχουν συσσωρευμένες γενετικές αλλαγές). Επειδή ο μηχανισμός με τον οποίο οι περισσότερες κυτταρικές σειρές γίνονται αθάνατες είναι γενικά άγνωστος, και επειδή ορισμένες κυτταρικές σειρές σχηματίζουν όγκους όταν εμβολιάζονται σε ανοσοανεπαρκή τρωκτικά, υπάρχουν πρόσθετες ανησυχίες για τις συνεχείς κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα διπλοειδή κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του ενδεχομένου ότι ο μετασχηματισμός προκλήθηκε από έναν τυχαίο παράγοντα και των πιθανών κινδύνων από το υπολειπόμενο DNA.
Τα προϊόντα που παρασκευάζονται σε κυτταρικές σειρές (συμπεριλαμβανομένων των ιικών εμβολίων) θα πρέπει να καθαρίζονται ώστε να είναι απαλλαγμένα (βλ. ενότητα V. Γλωσσάριο) από τυχαίους παράγοντες και υπολείμματα κυττάρων και θα πρέπει να έχουν χαμηλά επίπεδα DNA κυτταρικού υποστρώματος. Όταν η πιθανή βιολογική δραστηριότητα του υπολειμματικού DNA υποστρώματος κυττάρων αποτελεί ανησυχία, θα πρέπει να εισαγάγετε διαδικασίες που απομακρύνουν ή αποικοδομούν εκτενώς το DNA. Εάν εξετάζετε τη χρήση κυτταρικών σειρών, σας ενθαρρύνουμε να αναπτύξετε και να αξιολογήσετε αποτελεσματικές μεθόδους καθαρισμού του προϊόντος σας ως βασικό στοιχείο κάθε προγράμματος ανάπτυξης προϊόντος".
"Τα βιολογικά σας υλικά εκκίνησης θα πρέπει να χαρακτηρίζονται επαρκώς ώστε να διασφαλίζεται ότι δεν επιμολύνουν το τελικό προϊόν με ξένους μολυσματικούς οργανισμούς, όπως βακτήρια, μύκητες, καλλιεργήσιμα και μη καλλιεργήσιμα μυκοπλάσματα και σπειροπλάσματα, μυκοβακτηρίδια, ιούς και τον ή τους παράγοντες που ευθύνονται για τις μεταδοτικές σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες (ΜΣΕ). Για να θεωρηθεί μια ουσία απαλλαγμένη από έναν μολυσματικό παράγοντα, η δοκιμασία σας θα πρέπει να αποδεικνύει, σε προκαθορισμένο επίπεδο ευαισθησίας, ότι μια ορισμένη ποσότητα της ουσίας είναι απαλλαγμένη από τον εν λόγω μολυσματικό παράγοντα. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια επικυρωμένη διαδικασία που είναι γνωστό ότι απομακρύνει μια επιμολυντική ουσία σε ένα καθορισμένο επίπεδο για να αποδειχθεί η απουσία της εν λόγω επιμολυντικής ουσίας".
"Ένας κατάλληλος όγκος θα πρέπει να εμβολιάζεται σε μονοστρωματικές καλλιέργειες τουλάχιστον 3 τύπων κυττάρων. Το προς εξέταση δείγμα πρέπει να αραιώνεται όσο το δυνατόν λιγότερο. Οι κυτταρικές καλλιέργειες πρέπει να παρατηρούνται για τουλάχιστον 2 εβδομάδες. Μετά από 2 εβδομάδες παρατήρησης, οι αρχικές καλλιέργειες υπερκειμένων ή λυμάτων από τράπεζες κυττάρων υποκαλλιεργούνται σε φρέσκα κύτταρα και παρατηρούνται για τουλάχιστον 2 επιπλέον εβδομάδες. Αυτή η υποκαλλιέργεια σε φρέσκα κύτταρα μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση μεταξύ μη ειδικής CPE και CPE που προκαλείται από ιό, καθώς οι τοξικές επιδράσεις του αρχικού δείγματος ή της διάρκειας στην καλλιέργεια θα αραιωθούν, ενώ η CPE που προκαλείται από ιό θα πρέπει να ενισχυθεί."
--Περίληψη:
Ο καθαρισμός αναφέρεται στον διαχωρισμό των σωματιδίων "ιού" από τα συστατικά του ξενιστή σε βιολογικά ενεργή κατάσταση
Ο καθαρισμένος "ιός" απαιτείται για την παραγωγή αντισωμάτων, τον φυσικό, βιοχημικό και μοριακό χαρακτηρισμό των απομονωθέντων "ιών"
Οι μέθοδοι καθαρισμού ποικίλλουν ανάλογα με τους διάφορους "ιούς" και δεν υπάρχουν καθολικές μέθοδοι καθαρισμού του "ιού".
Διαδικασίες που είναι αποτελεσματικές για έναν "ιό" μπορεί να μην λειτουργούν με τον άλλο
Ως η πιο κοινή μέθοδος καθαρισμού, η υπερφυγοκέντρηση δεν είναι ιδανική για το διαχωρισμό εξωσωμάτων (δηλαδή μη μολυσματικών "ιών") και "ιών", ιδίως από μολυσμένες καλλιέργειες ή/και σωματικά υγρά.
Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται από τους ερευνητές για τον καθαρισμό των εξωσωμάτων και των "ιών" είναι παρόμοιες
Καμία από τις μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης της υπερφυγοκέντρησης, της καθίζησης και της χρωματογραφίας, δεν μπορεί να διαχωρίσει τα εξωσώματα από τους "ιούς"
Οι συνήθεις τεχνικές διαχωρισμού των εξωσωμάτων πάσχουν από πολυπλοκότητα λειτουργίας, χρονοβόρες διαδικασίες, μεγάλους όγκους δειγμάτων και χαμηλή καθαρότητα
Επί του παρόντος, οι κοινές τεχνολογίες απομόνωσης εξωσωμάτων, όπως η υπερδιήθηση, η ανοσοαπομόνωση, η υπερφυγοκέντρηση ("χρυσός κανόνας" για την απομόνωση των εξωσωμάτων) είναι ακριβά όργανα, μεγάλοι όγκοι δείγματος, πιθανή μόλυνση από πρωτεΐνες, πλήρη στάδια απομόνωσης, αλλά οδηγούν σε χαμηλή απόδοση απομόνωσης, απώλεια δείγματος, χαμηλή ανάκτηση και καθαρότητα εξωσωμάτων
Όπως και οι "ιοί", τα εξωσώματα είναι μικρά σε μέγεθος (30-150 nm), χαμηλής πυκνότητας (1,13-1,19 g/ml) και αναμειγνύονται με παρόμοια συστατικά (π.χ. κυτταρικά θραύσματα, πρωτεΐνες) στα σωματικά υγρά, γεγονός που δημιουργεί τεράστιες προκλήσεις για τον διαχωρισμό τους
Τα εξωσώματα είναι εξωκυτταρικά κυστίδια που πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων μεταφέροντας υλικά στο εσωτερικό του κυστιδίου
Η πρόκληση στην απομόνωση των κυστιδίων είναι η διαφοροποίησή τους από άλλους τύπους μεμβρανικού υλικού στο υπερκείμενο της κυτταροκαλλιέργειας
Αυτό επιτυγχάνεται μέσω διαδοχικών βημάτων φυγοκέντρησης σε αυξανόμενες ταχύτητες
Ωστόσο, αυτός ο τύπος προετοιμασίας είναι περισσότερο ένας εμπλουτισμός του δείγματος παρά ένας καθαρισμός
Εκτός από τα εξωσωμάτια, το εξωκυτταρικό περιβάλλον περιέχει εξωκυτταρικό RNA, άλλους τύπους κυστιδίων, πρωτεϊνικά σύμπλοκα και λιποπρωτεΐνες
Αυτά δεν διαχωρίζονται πλήρως από τα εξωσώματα μέσω του πρωτοκόλλου φυγοκέντρησης
Η Εκτελεστική Επιτροπή της Διεθνούς Εταιρείας Εξωκυτταρικών Κυστιδίων (ISEV) πρότεινε κριτήρια για τον χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων για να βοηθήσει στην αποτελούμενη αναφορά των πειραματικών αποτελεσμάτων και στο πλαίσιο αυτών των κριτηρίων αναφέρει
Να απομονώνονται από εξωκυτταρικά υγρά, όπως το μέσο κυτταροκαλλιέργειας ή τα σωματικά υγρά. Η συλλογή θα πρέπει να είναι ήπια ώστε να ελαχιστοποιείται η διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος που θα μπορούσε να επιμολύνει το δείγμα με ενδοκυτταρικά διαμερίσματα
Να έχουν επίπεδα πρωτεϊνών που δεν αναμένεται να εμπλουτιστούν για να προσδιοριστεί ο βαθμός συν-απομόνωσης των ενδοκυττάριων κυστιδίων
Με άλλα λόγια, είναι γνωστό ότι άλλα ενδοκυτταρικά συστατικά θα "απομονωθούν" μαζί με τα εξωσώματα
Η μελέτη των εξωσωμάτων αποτελεί πλούσιο πεδίο έρευνας λόγω του μεγάλου αριθμού αναπάντητων ερωτημάτων, όπως
Πώς ακριβώς σχηματίζονται
Ποιες είναι οι λειτουργίες τους
Πώς επικοινωνούν με τα κύτταρα-αποδέκτες
Ο ρόλος τους σε διάφορες ασθένειες
Απαιτούνται συνεπείς μέθοδοι για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων και τη διάκρισή τους από άλλους τύπους εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών κυστιδίων, ώστε να καταστεί δυνατή αυτή η πρόοδος
Στην παρασκευή εμβολίων, η καλλιέργεια κυττάρων συνοδεύεται συνήθως από:
κυτταρικά υπολείμματα
Ανεπιθύμητες πρωτεΐνες του μέσου
Τυχαίους παράγοντες
Υπολειμματικό DNA
Νουκλεϊκό οξύ
Πολλούς μολυσματικούς παράγοντες που σχετίζονται με τη διεργασία
Η παραγωγή εμβολίων στη θεραπευτική βιομηχανία πραγματοποιείται επί του παρόντος κατά περίπτωση για κάθε "ιό" και δεν υπάρχει ακόμη ένα ενιαίο σύστημα πλατφόρμας για τον καθαρισμό των "ιών".
Ένα παραδοσιακό σύστηµα ATPS χρησιµοποιήθηκε για την καταβύθιση των "ιών", αλλά η έλλειψη επιλεκτικότητας για τους "ιούς" έναντι των πρωτεϊνικών προσµίξεων και η δυσκολία διαχωρισµού από την πολυµερική φάση ανέστειλαν την πρόοδο του ATPS προς τα συστήµατα ανάπτυξης εµβολίων
Το σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG)/υδατικό σύστημα δύο φάσεων έχει επίσης μελετηθεί για τον καθαρισμό του "ιού", αλλά η τεχνική δεν έχει την ικανότητα καθαρισμού του "ιού" από πολλές προσμίξεις κυτταροκαλλιεργειών.
Η χρωματογραφία, μια δημοφιλής τεχνική για βιομοριακό καθαρισμό, έχει χρησιμοποιηθεί σπάνια για την ανάκτηση "ιών" λόγω των περιορισμών διάχυσης και του μεγάλου μεγέθους του "ιού", που περιορίζουν την πρόσβαση στην εσωτερική επιφάνεια των σφαιριδίων.
Ο "ιός" που παράγεται στο εργαστήριο είναι σε μεγάλο βαθμό μολυσμένος με πρωτεΐνες του κυτταρικού μέσου.
Ο καθαρισμός του "ιού" πραγματοποιείται συνήθως από φυγοκέντρηση με διαβάθμιση πυκνότητας ή τεχνικές καθίζησης αλάτων ή πολυμερών
Οι μέθοδοι είναι δύσκολο να επεκταθούν ή στερούνται εξειδίκευσης από τη συν-κατακρήμνιση προσμίξεων
Απαιτείται ένα αποτελεσματικό και γρήγορο σύστημα για την επίτευξη "ιού" υψηλής καθαρότητας
Σύμφωνα με την αναπληρώτρια καθηγήτρια και μικροβιολόγο Siouxsie Wiles του Πανεπιστημίου του Όκλαντ, "οι ιοί είναι βασικά άψυχα αντικείμενα που χρειάζονται μια καλλιέργεια για να ενεργοποιηθούν μέσα σε αυτήν. Όμως ο τρόπος με τον οποίο διατυπώνουν τα αιτήματα είναι ότι το δείγμα πρέπει να είναι εντελώς ανόθευτο και να μην έχει αναπτυχθεί σε καμία καλλιέργεια - και αυτό δεν μπορείς να το κάνεις. Δεν μπορείτε να απομονώσετε έναν ιό χωρίς να χρησιμοποιήσετε κυτταρική καλλιέργεια, οπότε σύμφωνα με τον ορισμό τους δεν έχει απομονωθεί. Όμως έχει απομονωθεί και καλλιεργηθεί με τη χρήση κυτταρικής καλλιέργειας πολλές φορές σε όλο τον κόσμο".
Σύμφωνα με το CDC, ο καθαρισμός "ιών" χωρίς καλλιέργεια κυττάρων είναι εκτός των δυνατοτήτων της ιολογίας
Με άλλα λόγια, είναι αδύνατο να καθαριστούν οι "ιοί" χωρίς καλλιέργεια και είναι επίσης αδύνατο να καθαριστούν και να απομονωθούν με καλλιέργεια
Από την καθοδήγηση του FDA για τη βιομηχανία, μαθαίνουμε ότι οι ζωντανοί εξασθενημένοι "ιοί", τα ολόκληρα αδρανοποιημένα "ιόντα" ή τα σωματίδια που μοιάζουν με "ιούς" συχνά δεν μπορούν να καθαριστούν τόσο αυστηρά όσο τα εμβόλια υπομονάδων "ιών"- κατά συνέπεια, η πιθανότητα μόλυνσης είναι μεγαλύτερη από εκείνη των εμβολίων υπομονάδων
Η παραγωγή ζωντανών "ιογενών" εμβολίων περιλαμβάνει συχνά κυτταρική διάσπαση, η οποία μπορεί να προσθέσει κυτταρικά συστατικά στον όγκο του εμβολίου.
Επιπλέον, τα εμβόλια αυτά συχνά καθαρίζονται ελάχιστα και δεν υποβάλλονται σε στάδια αδρανοποίησης.
Η ολοκληρωμένη δοκιμή και ο χαρακτηρισμός των βιολογικών αρχικών υλικών και ο έλεγχος παρτίδας προς παρτίδα για τυχαίους παράγοντες είναι ιδιαίτερα σημαντικοί, διότι ο παρασκευαστής ζωντανών "ιογενών" εμβολίων δεν είναι δυνατόν να επικυρώσει τη διαδικασία για την απομάκρυνση τυχαίων παραγόντων.
Για τα αδρανοποιημένα εμβόλια, η ανησυχία είναι ότι η διαδικασία που χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση του "ιού" του εμβολίου μπορεί να μην αδρανοποιήσει όλους τους τυχαίους παράγοντες που ενδεχομένως υπάρχουν (όπως συνέβη με τα πρώτα αδρανοποιημένα εμβόλια πολιοϊού).
Ο βαθμός εκκαθάρισης του "ιού" που είναι εφικτός μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των δοκιμών που πρέπει να διενεργούνται για να αποδειχθεί η απουσία επιμολυντών στο προϊόν.
Είναι σημαντικό να εντοπιστούν και να εξεταστούν όλες οι πιθανές πηγές μόλυνσης του προϊόντος, όπως:
Το άτομο ή το ζώο από το οποίο απομονώθηκε
Τα κύτταρα και οι πρώτες ύλες (π.χ. ορός ή θρυψίνη) που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση και την εξασθένησή του.
Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην τράπεζα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για την ανάπτυξη "ιικού" σπόρου
Άλλα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν κατά την παραγωγή και το γέμισμα του σπόρου
Επιπλέον, κάθε μολυσματικός "ιός" (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μολύνουν μη ανθρώπινα είδη) θα πρέπει να θεωρείται ως πιθανή επιμόλυνση εάν υπάρχει η πιθανότητα επαφής με το προϊόν ή το κυτταρικό υπόστρωμα σε οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ή της παραγωγής
Οι "ρετροϊοί" μπορεί να είναι είτε ενδογενείς (από το γονιδίωμα του ξενιστή) είτε εξωγενώς αποκτηθέντες
Η ευαισθησία του κυτταρικού υποστρώματος στη μόλυνση από παράγοντες δυνητικής ανησυχίας μπορεί να επηρεάσει τις δοκιμές που απαιτούνται για τη διασφάλιση της απουσίας μόλυνσης.
Εάν χρησιμοποιούνται πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες για τον πολλαπλασιασμό του "ιού" του εμβολίου, η πλήρης δοκιμή της πρωτογενούς καλλιέργειας μπορεί να μην είναι εφικτή πριν από τον εμβολιασμό του "ιού".
Στην περίπτωση αυτή, όταν είναι δυνατόν, πρέπει να παράγουν και να δοκιμάζουν μη μολυσμένες καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου που προέρχονται παράλληλα με την καλλιέργεια παραγωγής και αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο με αυτήν
Με άλλα λόγια, εάν αποφασίσουν ότι δεν μπορούν να ελέγξουν την μη μολυσμένη καλλιέργεια που χρησιμοποιείται για το εμβόλιο ως προς τη μόλυνση, αρκεί η χρήση μιας άλλης μη μολυσμένης καλλιέργειας ως υποκατάστατου
Οι καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου πρέπει να πολλαπλασιάζονται υπό συνθήκες παρόμοιες (δηλαδή όχι ίδιες) με τις συνθήκες παραγωγής για χρονικό διάστημα κατάλληλο για το λόγο εκτέλεσης των καλλιεργειών.
Οι καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία ταυτόχρονα με την καλλιέργεια παραγωγής, αλλά να μην έχουν μολυνθεί.
Οι κυτταρικές σειρές, όπως οι Vero και CHO, ενδέχεται να έχουν βιοχημικά, βιολογικά και γενετικά χαρακτηριστικά που διαφέρουν από τα πρωτογενή ή διπλοειδή κύτταρα (π.χ. είναι συνήθως ανευπλοειδή και έχουν συσσωρευμένες γενετικές αλλαγές)
Επειδή ο μηχανισμός με τον οποίο οι περισσότερες κυτταρικές σειρές γίνονται αθάνατες είναι γενικά άγνωστος και επειδή ορισμένες κυτταρικές σειρές σχηματίζουν όγκους όταν εμβολιάζονται σε ανοσοανεπαρκή τρωκτικά, υπάρχουν πρόσθετες ανησυχίες για τις συνεχείς κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα διπλοειδή κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του ενδεχομένου ότι ο μετασχηματισμός προκλήθηκε από έναν τυχαίο παράγοντα και των πιθανών κινδύνων από το υπολειπόμενο DNA
Τα προϊόντα που παρασκευάζονται σε κυτταρικές σειρές (συμπεριλαμβανομένων των "ιογενών" εμβολίων) θα πρέπει να καθαρίζονται ώστε να είναι απαλλαγμένα από τυχαίους παράγοντες και υπολείμματα κυττάρων και να έχουν χαμηλά επίπεδα DNA κυτταρικού υποστρώματος.
Όταν η δυνητική βιολογική δραστηριότητα του υπολειπόμενου DNA υποστρώματος κυττάρων είναι ανησυχητική, θα πρέπει να εφαρμόζονται διαδικασίες που απομακρύνουν ή αποικοδομούν σε μεγάλο βαθμό το DNA.
Εάν εξετάζεται η χρήση κυτταρικών σειρών, ενθαρρύνεται (δεν απαιτείται) η ανάπτυξη και αξιολόγηση αποτελεσματικών μεθόδων καθαρισμού του προϊόντος ως ουσιαστικό στοιχείο κάθε προγράμματος ανάπτυξης προϊόντος.
Τα βιολογικά υλικά εκκίνησης πρέπει να χαρακτηρίζονται επαρκώς ώστε να διασφαλίζεται ότι δεν επιμολύνουν το τελικό προϊόν με ξένους μολυσματικούς οργανισμούς όπως:
Βακτήρια
Μύκητες
καλλιεργήσιμα και μη καλλιεργήσιμα μυκοπλάσματα και σπειροπλάσματα
Μυκοβακτηρίδια
"Ιοί"
Παράγοντες που ευθύνονται για τις μεταδοτικές σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες (ΜΣΕ)
Για να θεωρηθεί μια ουσία απαλλαγμένη από έναν μολυσματικό παράγοντα, η δοκιμασία πρέπει να αποδεικνύει, σε προκαθορισμένο επίπεδο ευαισθησίας, ότι μια ορισμένη ποσότητα της ουσίας είναι απαλλαγμένη από τον εν λόγω μολυσματικό παράγοντα (δηλαδή δεν πρέπει να αποδειχθεί ότι το σύνολο της ουσίας είναι απαλλαγμένο από μόλυνση).
Εναλλακτικά, μια επικυρωμένη διαδικασία που είναι γνωστό ότι απομακρύνει μια επιμόλυνση σε ένα καθορισμένο επίπεδο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει (δηλαδή να συμπεράνει) την απουσία της εν λόγω επιμόλυνσης.
Οι κυτταροκαλλιέργειες πρέπει να παρατηρούνται για τουλάχιστον 2 εβδομάδες και μετά από 2 εβδομάδες παρατήρησης, οι αρχικές καλλιέργειες υπερκειμένων ή λυμάτων από τράπεζες κυττάρων υποκαλλιεργούνται σε φρέσκα κύτταρα και παρατηρούνται για τουλάχιστον επιπλέον 2 εβδομάδες
Αυτή η υποκαλλιέργεια σε φρέσκα κύτταρα μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση μεταξύ μη ειδικής CPE και "επαγόμενης από ιό" CPE, καθώς οι τοξικές επιδράσεις του αρχικού δείγματος ή του μήκους στην καλλιέργεια θα αραιωθούν, ενώ η "επαγόμενη από ιό" CPE θα πρέπει να ενισχυθεί
Με άλλα λόγια, γίνεται δεκτό ότι η CPE που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση "ιών" μπορεί να προκαλείται από παράγοντες άλλους από τους "ιούς" καταστρέφοντας έτσι το φαινόμενο αυτό ως έμμεσο δείκτη της παρουσίας οποιουδήποτε "ιού"
https://ajp.amjpathol.org/article/S0002-9440%2820%2930503-4/fulltext
"Προφανώς ο κύριος στόχος στον καθαρισμό και την απομόνωση των ιών είναι ο διαχωρισμός του ιού από τους ιστούς και τα κυτταρικά οργανίδια του ξενιστή".
DOI: 10.1007/978-94-009-5876-0_3
Θα πρέπει να έχει γίνει πλέον σαφές ότι η ιολογία δεν μπορεί να καθαρίσει πλήρως και επομένως να απομονώσει τα σωματίδια που θεωρούνται "ιοί" από οτιδήποτε άλλο είναι βέβαιο ότι υπάρχει μέσα στο δείγμα. Οι ιολόγοι παραδέχονται ανοιχτά ότι:
Δεν μπορούν να καθαρίσουν απευθείας από τα υγρά των ανθρώπων
Δεν μπορούν να καθαρίσουν τα σωματίδια από το υπερκείμενο των κυτταροκαλλιεργειών
Δεν μπορούν να διαχωρίσουν τους "ιούς" από τα εξωσώματα και άλλα παρόμοια MVB's
Δεν μπορούν να διαχωρίσουν τους "ιούς" από το υλικό ξενιστή κυτταροκαλλιέργειας και το DNA
Δεν μπορούν να διαχωρίσουν το μέσο κυτταροκαλλιέργειας από το δείγμα
Καθώς δεν μπορεί να επιτευχθεί καθαρισμός, η ιολογία στερείται των φυσικών σωματιδίων που είναι απαραίτητα για χρήση ως ανεξάρτητη μεταβλητή που μπορεί να μεταβληθεί και να χειριστεί προκειμένου να προσδιοριστεί η αιτία και το αποτέλεσμα. Δεν υπάρχουν άμεσες αποδείξεις για την ύπαρξη των σωματιδίων που υποτίθεται ότι είναι "ιός", τα οποία βρέθηκαν ποτέ μέσα στον άνθρωπο. Οι μόνες αποδείξεις προέρχονται από έμμεσους πειραματισμούς σε κυτταροκαλλιέργειες, οι οποίοι αναφέρουν πρότυπα κυτταρικού θανάτου γνωστά ως κυτταροπαθογόνο φαινόμενο (CPE) που παρατηρείται στα κύτταρα μετά από δηλητηρίαση και πείνα για ημέρες, τα οποία στη συνέχεια αποδίδονται σε έναν αόρατο "ιό". Καθώς άλλες μολυσματικές ουσίες, χημικές ουσίες και ακαθαρσίες παραμένουν μέσα στο δείγμα καλλιέργειας, δεν μπορεί να υπάρξει βεβαιότητα ότι οι άλλες ουσίες μέσα σε αυτό μπορεί να είναι η πιθανή αιτία του CPE που παρατηρείται μέσα στην καλλιέργεια σε σχέση με τον υποτιθέμενο "ιό". Είναι γεγονός ότι άλλες ουσίες θα υπάρχουν μέσα στα υγρά, ειδικά σε οποιοδήποτε δείγμα που έχει υποστεί επεξεργασία μέσω κυτταροκαλλιέργειας, όπως φαίνεται από τις μελέτες για τα εξώσωμα καθώς και από τις προσπάθειες καθαρισμού "ιών" από υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας για χρήση σε εμβόλια. Ο FDA παραδέχτηκε ότι υπάρχουν και άλλοι παράγοντες εκτός από έναν "ιό" που μπορούν να προκαλέσουν το CPE που παρατηρείται, το οποίο αντί να κατηγορείται στον αόρατο "ιό". Η μέθοδος της κυτταροκαλλιέργειας είναι εξ ορισμού μια ακάθαρτη διαδικασία, καθώς στην καλλιέργεια προστίθενται πολλά ξένα στοιχεία, χημικές ουσίες και μολυσματικές ουσίες που δεν μπορούν να διαχωριστούν. Καθώς η ιολογία παραδέχεται ότι οι "ιοί" δεν μπορούν να καθαριστούν και να απομονωθούν απευθείας από τα υγρά ενός άρρωστου ανθρώπου και πρέπει να καλλιεργηθούν, δεν υπάρχει κανένας καθαρισμός που μπορεί ποτέ να επιτευχθεί με την υποβολή σε μια ακάθαρτη διαδικασία.
Χωρίς καθαρισμό, η ιολογία δεν μπορεί να τηρήσει την επιστημονική μέθοδο και συνεπώς αποτελεί ψευδοεπιστήμη. Το γνωρίζουμε αυτό και οι ιολόγοι το γνωρίζουν αυτό και γι' αυτό οι μέθοδοι καθαρισμού σπάνια εκτελούνται και γι' αυτό το κριτήριο αυτό σπάνια συζητείται στα έγγραφα της ιολογίας. Ο καθαρισμός είναι το μαύρο πρόβατο της οικογένειας της ιολογίας και θα παραμείνει έτσι μέχρι η ιολογία να βρει έναν τρόπο να κάνει αυτό που δεν μπορεί να κάνει για πάνω από 100 χρόνια.
************
Δικτυογραφία
Purification: Virology’s Black Sheep – ViroLIEgy
https://viroliegy.com/2022/06/16/purification-virologys-black-sheep/
Αναρτήσεις
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου
ΠΕΣ ΤΗΝ ΑΠΟΨΗ ΣΟΥ ΧΩΡΙΣ ΥΒΡΕΙΣ. Παρατηρούμε ακραίες τοποθετήσεις αναγνωστών. ΠΑΡΑΚΛΗΣΗ δεν θέλουμε να μπαίνουμε στη δύσκολη θέση να μην βάζουμε ΟΛΑ τα σχόλια. Δόξα στο Θεό η Ελληνική γλώσα είναι πλούσια ωστε να μην χρειάζονται ακραίες εκφράσεις.